El análisis de variantes es hoy una herramienta clave en la investigación biomédica. Aun así, sabemos que trabajar con datos genómicos complejos no siempre es sencillo. En Biotechvana queremos acompañarle en ese proceso, actuando como un socio de confianza entre la secuenciación masiva y la interpretación biológica, con servicios de genotipado sólidos, transparentes y pensados para las personas que están detrás de cada proyecto.
Cada estudio plantea preguntas distintas, y la bioinformática no debería ser una solución única para todos los casos. Por eso adaptamos nuestros flujos de trabajo a sus necesidades concretas: desde análisis de exoma y genoma completos para estudios mendelianos, hasta pipelines específicos para investigación en cáncer. Del mismo modo, nuestra experiencia abarca el procesamiento de amplicones y sistemas de captura, asegurando la máxima precisión tanto en análisis globales como en paneles dirigidos.
Nuestro principal valor está en la personalización. Analizamos en detalle su diseño experimental y ajustamos cuidadosamente los parámetros de detección y anotación para ofrecer resultados fiables, claros y listos para ser interpretados en su contexto clínico o de investigación básica.
Este flujo de trabajo está diseñado para identificar variantes de línea germinal asociadas a enfermedades hereditarias o rasgos genéticos específicos. Nuestro enfoque combina un control exhaustivo de la calidad de los datos con un análisis riguroso de los modelos de herencia familiar, ya sea mediante el estudio de tríos o pedigríes complejos. A través de una anotación funcional profunda, priorizamos aquellas variantes con impacto patogénico real, transformando los datos genómicos en resultados biológicamente relevantes que permiten identificar con precisión la causa genética subyacente.
- Análisis de calidad de las lecturas de secuenciación (FASTQ) mediante métricas estándar.
- Preprocesado de lecturas, incluido demultiplexado y eliminación de secuencias de baja calidad, restos de primers/adaptadores y artefactos.
- Curado de lecturas cuando sea apropiado.
- Alineamiento de las lecturas procesadas contra el genoma/transcriptoma de referencia.
- Generación de métricas de alineamiento: porcentaje de mapeo, cobertura media, uniformidad de la cobertura y lecturas "off-target" (en exomas).
- Marcado y eliminación de duplicados de PCR para evitar sesgos en la cuantificación de variantes.
- Recalibración de la calidad de las bases (BQSR) para ajustar los scores de calidad empíricos y reducir falsos positivos sistemáticos.
- Refinamiento del alineamiento en zonas de inserciones/deleciones (Indels).
- Llamada de variantes (Variant Calling) de tipo SNP e Indels utilizando algoritmos de alta sensibilidad para línea germinal (ej. HaplotypeCaller).
- Genotipado conjunto (Joint Genotyping) en cohortes o tríos familiares para aumentar la potencia estadística.
- Detección de variantes estructurales (CNVs, grandes deleciones/duplicaciones) adaptada a datos de exoma o genoma.
- Anotación exhaustiva con bases de datos poblacionales (gnomAD, 1000G) y clínicas (ClinVar, OMIM, dbSNP).
- Filtrado por calidad técnica (profundidad de lectura, calidad del genotipo, sesgos de hebra).
- Filtrado por frecuencia poblacional: selección de variantes raras (<1% o <5% según fenotipo).
- Priorización biológica: análisis de segregación familiar (modelos dominantes, recesivos, de novo, ligados al X).
- Clasificación de patogenicidad según guías ACMG.
Este protocolo aborda la complejidad biológica del tumor mediante un enfoque bioinformático diseñado para gestionar la heterogeneidad y la pureza de la muestra. El análisis se centra en la diferenciación precisa entre variantes somáticas y germinales, permitiendo identificar mutaciones conductoras (drivers) incluso en frecuencias alélicas bajas. Además de la detección de SNPs e indels, evaluamos la carga mutacional (TMB), las firmas mutacionales y las alteraciones estructurales o de número de copias (CNVs), proporcionando una visión integral del paisaje genómico tumoral.
- Creación de panel de normales (PON) que nos permite identificar y filtrar artefactos recurrentes de la secuenciación.
- Control de calidad exhaustivo de los archivos FASTQ (Tumor y Normal si está disponible).
- Limpieza rigurosa de las lecturas para reducir falsos positivos, especialmente en la detección de mutaciones de baja frecuencia.
- Alineamiento contra el genoma de referencia.
- Inferencia de métricas sobre rendimiento de mapeo.
- Marcado de duplicados.
- Recalibración de bases (BQSR), un paso crítico para detectar variantes con baja frecuencia alélica (VAF).
- Llamada de variantes somáticas (SNVs e Indels) mediante la comparación de pares Tumor-Normal, o en modo tumor-only cuando el diseño experimental lo requiere.
- Aplicación de Panel de Normales (PON) para filtrar ruido técnico y artefactos recurrentes de secuenciación.
- Estimación de pureza tumoral y ploidía.
- Análisis de variaciones en el número de copias (CNVs) somáticas y pérdida de heterocigosidad (LOH).
- Detección de variantes estructurales complejas (translocaciones, inversiones).
- Exclusión de variantes germinales para aislar mutaciones exclusivas del tumor.
- Filtrado de variantes por frecuencia alélica (VAF) y profundidad de cobertura.
- Anotación de variantes con bases de datos oncológicas de referencia (COSMIC, CIViC, OncoKB).
- Identificación de variantes driver (conductoras) vs passenger (pasajeras).
- Reporte de biomarcadores con valor predictivo o pronóstico (ej. carga mutacional tumoral - TMB, inestabilidad de microsatélites - MSI).
Este protocolo está orientado a obtener la máxima profundidad y precisión en regiones genómicas restringidas, siendo la opción ideal para estudios de paneles dirigidos o validación de variantes. Gracias a su alta sensibilidad, es especialmente eficaz en la detección de variantes de baja frecuencia, esenciales en el análisis de mosaicismos o en proyectos de biopsia líquida. El flujo de trabajo asegura una cobertura uniforme y una fiabilidad estadística superior, garantizando que cada lectura contribuya a un resultado robusto y reproducible en las regiones de mayor interés.
- Análisis de calidad de lecturas.
- Eliminación estricta de secuencias de primers (cebadores) y adaptadores específicos del kit de captura/amplicones para evitar falsos positivos en los extremos de las lecturas.
- Fusión de lecturas (merging) en caso de amplicones solapantes si el diseño lo requiere.
- Alineamiento restringido o enfocado a las regiones diana (ROI - Regions of Interest).
- Métricas de rendimiento "On-target": porcentaje de lecturas que se alinean dentro del diseño del panel frente a regiones flanqueantes.
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Tratamiento de duplicados:
- En captura híbrida: marcado y eliminación de duplicados (PCR dedup).
- En amplicones: gestión de duplicados biológicos vs técnicos (o uso de UMIs - Unique Molecular Identifiers si están presentes para corrección de errores).
- Realineamiento local alrededor de indels.
- Llamada de variantes con parámetros ajustados para alta profundidad (high-depth).
- Detección de variantes de baja frecuencia (mosaicismo o subclonalidad) gracias a la alta cobertura.
- Anotación funcional de las variantes encontradas dentro de las regiones del panel.
- Filtrado estricto por cobertura mínima (ej. >100x o >500x según contexto clínico/investigación).
- Análisis del sesgo de hebra para descartar errores de PCR.
- Validación de variantes específicas solicitadas por el cliente.
- Reporte enfocado en los genes de interés del panel diseñado.